Seurat的scATAC-seq分析流程

Seurat的scATAC-seq分析流程

Seurat 3.X版本能够整合scRNA-seq和scATAC-seq, 主要体现在:

  • 基于scRNA-seq的聚类结果对scATAC-seq的细胞进行聚类
  • scRNA-seq和scATAC-seq共嵌入(co-embed)分析

整合步骤包括如下步骤:

  1. 从ATAC-seq中估计RNA-seq表达水平,即从ATAC-seq reads定量基因表达活跃度
  2. 使用LSI学习ATAC-seq数据的内部结构
  3. 鉴定ATAC-seq和RNA-seq数据集的锚点
  4. 数据集间进行转移,包括聚类的标签,在ATAC-seq数据中推测RNA水平用于共嵌入分析

数据下载

测试数据下载地址:

可以复制下载链接到浏览器下载,也可以直接在R语言用download.file中进行下载。

# 下载peak
atac_peak <- "http://cf.10xgenomics.com/samples/cell-atac/1.0.1/atac_v1_pbmc_10k/atac_v1_pbmc_10k_filtered_peak_bc_matrix.h5"
atac_peak_file <- "atac_v1_pbmc_10k_filtered_peak_bc_matrix.h5"
download.file(atac_peak, atac_peak_file)

# 下载singlecell.csv
singlecell <- "http://cf.10xgenomics.com/samples/cell-atac/1.0.1/atac_v1_pbmc_10k/atac_v1_pbmc_10k_singlecell.csv"
singlecell_file <- "atac_v1_pbmc_10k_singlecell.csv"
download.file(singlecell, singlecell_file)

# 下载rna-seq
rna_seq <- "http://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_10k_v3/pbmc_10k_v3_filtered_feature_bc_matrix.h5"
rna_seq_file <- "pbmc_10k_v3_filtered_feature_bc_matrix.h5"
download.file(rna_seq, rna_seq_file)

# 下载GTF
gtf <- "ftp://ftp.ensembl.org/pub/grch37/release-82/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh37.82.gtf.gz"
gtf_file <- "Homo_sapiens.GRCh37.82.gtf.gz"
download.file(gtf, gtf_file)

基因活跃度定量

首先,先将peak矩阵转成基因活跃度矩阵。Seurat做了一个简单的假设,基因活跃度可以通过简单的将落在基因区和其上游2kb的count相加得到基因活跃度,并且这个结果Cicero等工具返回gene-by-cell矩阵是类似的。

library(Seurat)
library(ggplot2)
# 读取peak
peaks <- Read10X_h5(atac_peak_file)
activity.matrix <- CreateGeneActivityMatrix(peak.matrix = peaks, 
                                            annotation.file = gtf_file, 
                                            seq.levels = c(1:22, "X", "Y"), 
                                            upstream = 2000, 
                                            verbose = TRUE)

activity.matrix是一个dgCMatrix对象,其中行为基因,列为细胞。因此如果对于Cicero的输出结果,只要提供相应的矩阵数据结构即可。

设置对象

下一步,我们要来设置Seurat对象,将原始的peak counts保存到assay中,命名为"ATAC"

pbmc.atac <- CreateSeuratObject(counts = peaks, assay = "ATAC", project = "10x_ATAC")

增加基因活跃度矩阵,命名为"ACTIVITY".

pbmc.atac[["ACTIVITY"]] <- CreateAssayObject(counts = activity.matrix)

增加细胞的元信息,该信息来自于scATAC-seq的CellRanger处理的singlecell.csv

meta <- read.table(singlecell_file, sep = ",", header = TRUE, row.names = 1, 
    stringsAsFactors = FALSE)
meta <- meta[colnames(pbmc.atac), ]
pbmc.atac <- AddMetaData(pbmc.atac, metadata = meta)

过滤掉scATAC-seq数据中总count数低于5000的细胞,这个阈值需要根据具体实验设置

pbmc.atac <- subset(pbmc.atac, subset = nCount_ATAC > 5000)
pbmc.atac$tech <- "atac"

数据预处理

为了找到scATAC-seq数据集和scRNA-seq数据集之间的锚定点,我们需要对基因活跃度矩阵进行预处理

设置pbmc.atac的默认Assay为"ACTIVITY", 然后寻找高表达的基因,对基因活跃度矩阵进行标准化和Scale。

DefaultAssay(pbmc.atac) <- "ACTIVITY"
pbmc.atac <- FindVariableFeatures(pbmc.atac)
pbmc.atac <- NormalizeData(pbmc.atac)
pbmc.atac <- ScaleData(pbmc.atac)

同样的,我们还需要对peak矩阵进行处理。这里我们用的隐语义(Latent semantic indexing, LSI)方法对scATAC-seq数据进行降维。该步骤学习scRNA-seq数据的内部结构,并且在转换信息时对锚点恰当权重的决定很重要。

根据 Cusanovich et al, Science 2015提出的LSI方法,他们搞了一个RunLSI函数。LSI的计算方法为TF-IDF加SVD。

我们使用在所有细胞中至少有100个read的peak,然后降维到50。该参数的选择受之前的scATAC-seq研究启发,所以没有更改,当然你你可以把它改了。

DefaultAssay(pbmc.atac) <- "ATAC"
VariableFeatures(pbmc.atac) <- names(which(Matrix::rowSums(pbmc.atac) > 100))
pbmc.atac <- RunLSI(pbmc.atac, n = 50, scale.max = NULL)
#pbmc.atac <- RunUMAP(pbmc.atac, reduction = "lsi", dims = 1:50)
pbmc.atac <- RunTSNE(pbmc.atac, reduction = "lsi", dims = 1:50)

: 要将pbmc.atac的默认assay切换成"ATAC", 非线性降维可以选择UMAP或者t-SNE。

我们之前使用过Seurat对scRNA-seq数据进行预处理和聚类,下载地址为Dropbox

pbmc.rna <- readRDS("pbmc_10k_v3.rds")
pbmc.rna$tech <- "rna"

将scRNA-seq和scATAC-seq共同展示,对一些骨髓(myeloid)和淋巴(lymphoid)PBMC中比较常见的聚类,其实是能从图中看出来。

p1 <- DimPlot(pbmc.atac, reduction = "tsne") + 
        NoLegend() + 
        ggtitle("scATAC-seq")
p2 <- DimPlot(pbmc.rna, group.by = "celltype", reduction = "tsne", label = TRUE, repel = TRUE) + 
        NoLegend() + 
        ggtitle("scRNA-seq")
CombinePlots(plots = list(p1, p2))

标签转移前

现在,我们用FindTransferAnchors鉴定scATAC-seq数据集和scRNA-seq数据集的锚点,然后根据这些锚点将 10K scRNA-seq数据中鉴定的细胞类型标记转移到scATAC-seq细胞中。

transfer.anchors <- FindTransferAnchors(reference = pbmc.rna, 
                                        query = pbmc.atac, 
                                        features = VariableFeatures(object = pbmc.rna), 
                                        reference.assay = "RNA", 
                                        query.assay = "ACTIVITY", 
                                        reduction = "cca")

Seurat比较的是scRNA-seq表达量矩阵和scATAC-seq中基因活跃度矩阵,利用CCA降维方法比较两者在scRNA-seq中的高变异基因的关系

为了转移细胞类群的编号,我们需要一组之前注释过的细胞类型,作为TransferData的 refdata 参数输入。TransferData本质上采用的是KNN算法,利用距离未知类型细胞的最近N个已知细胞所属的类型来定义该细胞。weight.reduction参数是用来选择设置权重的降维。

celltype.predictions <- TransferData(anchorset = transfer.anchors, 
                                     refdata = pbmc.rna$celltype, 
                                     weight.reduction = pbmc.atac[["lsi"]])
pbmc.atac <- AddMetaData(pbmc.atac, metadata = celltype.predictions)

我们可以检查每个细胞预测得分的分布情况,选择性的过滤哪些得分比较低的细胞。我们发现超过95%的细胞得分大于或等于0.5.

hist(pbmc.atac$prediction.score.max)
abline(v = 0.5, col = "red")

得分分布

table(pbmc.atac$prediction.score.max > 0.5)
# FALSE  TRUE 
#   383  7483 

之后,我们就可以在UMAP上检查预测的细胞类型的分布,检查细胞类型在scRNA-seq和scATAC-seq中的相对位置

pbmc.atac.filtered <- subset(pbmc.atac, 
                             subset = prediction.score.max > 0.5)
pbmc.atac.filtered$predicted.id <- factor(pbmc.atac.filtered$predicted.id, 
                                          levels = levels(pbmc.rna))  # to make the colors match
p1 <- DimPlot(pbmc.atac.filtered, 
              group.by = "predicted.id",
              label = TRUE, 
              repel = TRUE) + 
        ggtitle("scATAC-seq cells") + 
        NoLegend() + 
        scale_colour_hue(drop = FALSE)
p2 <- DimPlot(pbmc.rna, group.by = "celltype", label = TRUE, repel = TRUE) +
        ggtitle("scRNA-seq cells") + 
        NoLegend()
CombinePlots(plots = list(p1, p2))

预测后结果

在转移细胞类型标记之后,我们就可以进行细胞特意水平上的下有分析。举个例子,我们可以去找一些某些细胞类型特异的增强子,寻找富集的motif。目前这些分析Seurat还不直接支持,还在调试中。

共嵌入(co-embedding)

最后,如果你想将所有的细胞一同展示,可以将scRNA-seq和scATAC-seq数据嵌入到相同的低维空间。

我们使用之前的锚点从scATAC-seq细胞中推断RNA-seq的值,后续分析就相当于两个单细胞数据的分析流程。

注意: 这一步只是为了可视化,其实不做也行。

选择用于估计的基因,可以是高变动基因,也可以是所有基因。

# 只选择高变动的基因作为参考
genes.use <- VariableFeatures(pbmc.rna)
refdata <- GetAssayData(pbmc.rna, assay = "RNA", slot = "data")[genes.use, ]

之后利用TransferData推断scATAC-seq在这些基因中的可能值,输出结果就是ATAC细胞对应的scRNA-seq矩阵

imputation <- TransferData(anchorset = transfer.anchors, 
                           refdata = refdata, 
                           weight.reduction = pbmc.atac[["lsi"]])
# this line adds the imputed data matrix to the pbmc.atac object
pbmc.atac[["RNA"]] <- imputation

合并两个的结果,然后就是scRNA-seq的常规分析。

coembed <- merge(x = pbmc.rna, y = pbmc.atac)
# 标准化分析
coembed <- ScaleData(coembed, features = genes.use, do.scale = FALSE)
coembed <- RunPCA(coembed, features = genes.use, verbose = FALSE)
#coembed <- RunUMAP(coembed, dims = 1:30)
coembed <- RunTSNE(coembed, dims = 1:30)
coembed$celltype <- ifelse(!is.na(coembed$celltype), coembed$celltype, coembed$predicted.id)

在t-SNE上绘制结果

p1 <- DimPlot(coembed, reduction="tsne", group.by = "tech")
p2 <- DimPlot(coembed, reduction="tsne", group.by = "celltype", label = TRUE, repel = TRUE)
CombinePlots(list(p1, p2))

tSNE plot

从上面的结果中,你可能会发现某些细胞只有在一类技术中存在。举个例子,从巨噬细胞(megakaryocytes)到成熟的血小板细胞(pletelet)由于没有细胞核,无法被scATAC-seq技术检测到。我们可以单独展示每个技术,进行检查

DimPlot(coembed, reduction="tsne", split.by = "tech", group.by = "celltype", label = TRUE, repel = TRUE) + NoLegend()

分别展示

此外,你还可以发现B细胞前体类型附近有一类细胞只由scATAC-seq的细胞构成。通过展示这些细胞在CellRanger分析结果提供的黑名单位置所占read数,可以推测出这类细胞可能是死细胞,或者是其他scRNA-seq无法检测的人为因素。

coembed$blacklist_region_fragments[is.na(coembed$blacklist_region_fragments)] <- 0
FeaturePlot(coembed, features = "blacklist_region_fragments", max.cutoff = 500)

黑名单区


Seurat这种基于基因活跃度得分进行细胞类型预测,是否靠谱,开发者提供了如下几个证据

  • 总体预测得分(pbmc.atac$prediction.score.max)高,意味着用scRNA-seq定义细胞类型比较可靠
  • 我们可以在scATC-seq降维结果中
  • 利用相同锚点的贡嵌入分析,发现两类形态能很好的混合
  • 将ATAC-seq数据根据聚类结果构建pseduo bulk, 发现和真实的bulk数据近似

参考资料:

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