「RNA-seq分析软件」RNA-seq比对工具STAR学习笔记

软件安装

软件的GitHub地址为https://github.com/alexdobin/STAR, 下载页面为https://github.com/alexdobin/STAR/releases, 挑最新的下载，避免bug。

软件使用

STAR的主程序只有两个:STAR和STARlong。前者用于比对RNA-seq数据，后者是针对于长读长RNA数据。由于同一个程序，又需要做建索引，又需要做序列比对，并且这个程序还支持一系列的输出格式，因此直接用STAR，你会迷失在参数的海洋中。所以我们需要先阅读文档，先对整体有一个了了解。

STAR的基本使用流程分为两步：

生成基因组索引文件。你需要提供基因组序列(FASTA)和注释文件(GTF)
将读段回帖到基因组。这一步需要提供的是RNA-seq数据，格式目前都是FASTQ/FASTA, 最后会得到很多很多的文件，常规的SAM/BAM文件，可变剪切点文件，未回帖上的读段和常用于展示信号的WIG文件。

STAR的使用格式为

STAR --option1-name option1-value --option2-name option2-value ...

建立索引

举例说明:

STAR  --runMode genomeGenerate \
    --genomeDir ref \
    --runThreadN 20 \
    --genomeFastaFiles reference.fa\
    --sjdbGTFfile reference.gtf

常用参数说明

--runThreadN 线程数 :设置线程数
--runMode genomeGenerate : 设置模式为构建索引
--genomedDir 索引文件存放路径 : 必须先创建文件夹
--genomeFastaFiles 基因组fasta文件路径 : 支持多文件路径
--sjdbGTFfile gtf文件路径 : 可选项，高度推荐,用于提高比对精确性
--sjdbOverhang 读段长度: 后续回帖读段的长度, 如果读长是PE 100，则该值设为100-1=99

几个额外要说明的点：

由于物种的组装的复杂性，存在一些为组装上的片段，这些片段不需要放在参考序列中，尤其是可变单倍型(alternative haplotypes)
如果基因组的contig过多，超过5000，你需要用 --genomeChrBinNbits=min(18,log2[max(GenomeLength/NumberOfReferences,ReadLength)]) 降低RAM消耗
选择最新的注释文件，人类和小鼠常在http://www.gencodegenes.org下载，植物的可信基因组见http://plants.ensembl.org
如果没有设置--sjdbGTFfile或--sjdbFileChrStartEnd，就不需要设置--sjdbOverhang

读段回帖

用法举例

STAR \
    --genomeDir ref \
     --runThreadN 20 \
    --readFilesIn sample_r1.fq.gz sample_r2.fq.gz \
    --readFilesCommand zcat \
    --outFileNamePrefix sample \
    --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
    --outBAMsortingThreadN 10

参数说明

--runThreadN 设置线程数
--runMode alignReads : 默认就是比对模式，可以不填写
--genomeDir: 索引文件夹
--readFilesIn FASTA/Q文件路径
--readFilesCommand zcat: 如果输入格式是gz结尾，那么需要加上zcat, 否则会报错
--outSAMtype: 输出SAM文件的格式，是否排序
--outBAMsortingThreadN: SAM排序成BAM时调用线程数

默认参数下，会输出文件在当前文件夹，

Aligned.out.sam  Log.final.out  Log.out  Log.progress.out   SJ.out.tab

可以用--outFileNamePrefix指定文件夹和前缀，其中"Aligned.out.sam"是默认回帖后输出。一般而言，SAM文件过大，不方便后续使用，我们更需要的是BAM文件。最好是类似于samtools sort的输出文件，那么设置参数为--outSAMtype BAM SortedByCoordinate。如果你设置的线程数非常大，那么你很有可能会遇到如下这种报错，我的解决方案就是降低线程数。

FATAL ERROR: number of bytes expected from the BAM bin does not agree with the actual size on disk

xxx.out文件是一些日志信息.

"SJ.out.tab"存放的高可信的剪切位点，每一列的含义如下

第一列: 染色体
第二列: 内含子起始（以1为基）
第三列: 内含子结束（以1为基）
第四列：所在链，1(+)，2(-)
第五列: 内含子类型，0表示不是下面的任何一种功能，1表示GT/AG, 2表示:GT/AC,3表示GC/AG,4表示GT/GC,5表示AT/GC,6表示GT/AT
第六列: 是否是已知的注释
第七列: 有多少唯一联配支持
第八列: 有多少多重联配支持
第九列: maximum spliced alignment overhang, 这个比较难以翻译，指的是当短读比对到剪切位点时，中间会被分开，另一边能和基因组匹配的数目，例如ACGTACGT----------ACGT，就是4或者8，取决于方向。

控制过滤的参数为--outSJfilter*系列，其中--outSJfilterCountUniqueMin 3 1 1 1表示4类内含子唯一匹配的read支持数至少为3,1,1,1, 而--outSJfilterCountTotalMin 3 1 1 1则表示4类内含子唯一匹配和多重匹配read的支持数和，至少为3,1,1,1。如果你设置的--outSJfilterReads Unique，那么上面两者是等价的，当然默认情况下是All

注意：双端测序中一定要注意不能把文件输入错了，不然比对率几乎为0。下面我一次脚本翻车记录，两个都是R1和R1，应该是R1和R2

翻车记录

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